Calculadora de Tm de Primer

Uma calculadora grátis de Tm de primer que computa a temperatura de fusão usando três métodos: Básico (regra de Wallace), Ajustado por Sal (Owczarzy) e Nearest-Neighbor (SantaLucia 1998 parâmetros unificados). Insira sua sequência de DNA e condições de PCR (Na⁺, concentração do primer, Mg²⁺) para obter valores de Tm com visualização de bases codificada por cores, barra de GC%, peso molecular e avisos de qualidade do primer — sem necessidade de cadastro.

Sequência do Primer (5′→3′)

5′-ATGCGATCGATCGTAGC-3′ (17 nt)

Na⁺ Concentração

Concentração do Primer

Mg²⁺ Concentração

Resultados de Temperatura de Fusão (Tm)

Básico (Wallace)

52.0°C

2(A+T) + 4(G+C)

Ajustado por Sal

46.3°C

Owczarzy

Nearest-Neighbor

51.2°C

SantaLucia 1998

Comprimento:17 nt

GC%:52.9%

MW:4281

Autocomplementar:Não

AT: 8GC: 9 (52.9%)

Todas as verificações de qualidade do primer foram aprovadas

Métodos de Cálculo de Tm

Básico (Wallace)— Regra de Wallace: Tm = 2(A+T) + 4(G+C). Estimativa simples para primers ≤14 nt. Não considera sal ou contexto de sequência.

Ajustado por Sal— Fórmula de Owczarzy: Tm = 81,5 + 16,6×log₁₀([Na⁺]) + 41×(GC/N) − 600/N. Considera concentração de Na⁺ e comprimento do primer.

Nearest-Neighbor— Parâmetros unificados SantaLucia 1998. Usa termodinâmica nearest-neighbor (ΔH, ΔS) para todos os 16 pares de dinucleotídeos. Mais preciso para primers típicos de PCR (15-30 nt).

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O que é uma Calculadora de Tm de Primer?

Uma calculadora de Tm de primer estima a temperatura de fusão na qual 50% do DNA dupla-fita dissocia em fitas simples. A temperatura de fusão é crítica para o design de primers de PCR — temperaturas ótimas de anelamento são tipicamente definidas 5°C abaixo da Tm. Esta calculadora fornece três métodos: a regra Básica de Wallace (2(A+T) + 4(G+C)) para estimativas rápidas, Ajustada por Sal (Owczarzy) considerando a concentração de Na⁺, e Nearest-Neighbor (SantaLucia 1998) usando parâmetros termodinâmicos (ΔH, ΔS) para todos os 16 pares de dinucleotídeos — o método mais preciso para primers de 15-30 nt.

Como Usar Esta Calculadora

Insira sua sequência de primer de DNA (direção 5′→3′, apenas bases A/T/G/C)
Ajuste as condições de PCR: concentração de Na⁺ (padrão 50 mM), concentração do primer (padrão 250 nM)
Visualize os resultados de Tm de três métodos — Nearest-Neighbor (destacado) é recomendado para a maioria dos primers
Verifique a barra de GC% e os avisos de qualidade do primer para possíveis problemas
Clique no botão copiar para exportar todos os resultados para seu caderno de laboratório

Perguntas Frequentes

Qual método de cálculo de Tm devo usar para design de primers de PCR?

Para primers de PCR de 15-30 nucleotídeos, o método Nearest-Neighbor (SantaLucia 1998) é o mais preciso porque considera o contexto de sequência de cada par de bases adjacente. A regra Básica/Wallace só é confiável para oligonucleotídeos curtos (≤14 nt), e o método Ajustado por Sal fornece um meio-termo quando você precisa de uma estimativa rápida que considere a força iônica.

Qual é o conteúdo GC ideal para um primer de PCR?

O conteúdo GC ideal para primers de PCR é 40-60%. Pares de bases GC formam três ligações de hidrogênio (versus duas para AT), então maior conteúdo GC aumenta a estabilidade de ligação. Abaixo de 40% GC, a ligação primer-molde pode ser muito fraca. Acima de 60%, o primer pode formar estruturas secundárias (hairpins, dímeros) que reduzem a eficiência de amplificação.

Como a concentração de Na⁺ afeta a Tm do primer?

Os íons sódio (Na⁺) neutralizam as cargas negativas no esqueleto de fosfato do DNA, estabilizando a dupla hélice e aumentando a Tm. Tampões padrão de PCR contêm cerca de 50 mM de Na⁺ equivalente (de KCl e outros sais). Concentrações mais altas de sal aumentam a Tm, enquanto concentrações mais baixas a diminuem. Os métodos Nearest-Neighbor e Ajustado por Sal consideram esse efeito.

O que significa o aviso de clamp GC?

Um clamp GC refere-se a ter múltiplas bases G ou C na extremidade 3′ do primer. Enquanto 1-2 bases GC na extremidade 3′ promovem ligação estável ao molde, ter 4 ou mais das últimas 5 bases como G/C pode causar estabilidade excessiva na extremidade 3′, levando a amplificação inespecífica e formação de dímeros de primer.